本文標題：" 細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)測定法-生物顯微鏡專業(yè)門市"

細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)測定法-生物顯微鏡專業(yè)門市

細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)（intracellular reactive oxygen species; ROS）之測定法

一、原理

H2DCF-DA 是一種染劑對過氧化氫（H2O2）相當敏感，可用來偵測細

胞內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物質(zhì)。H2DCF-DA 為不具螢光的物質(zhì)，加至培養(yǎng)液中可經(jīng)

由擴散作用通過細胞膜進入細胞內(nèi)；而細胞內(nèi)的酵素酯醣（esterase）會對

H2DCF-DA 進行去乙醯化作用（deacetylation），進而形成極性的化合物

（H2DCF），因為 H2DCF 無法穿透細胞膜并被留在細胞內(nèi)；由于其不具螢光

的特性，但當細胞內(nèi)有過氧化物質(zhì)存在時，會使 H2DCF 氧化而成為具有螢

光的產(chǎn)物（DCF）。當細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)產(chǎn)生量越多，H2DCF 被氧化成帶螢

光的產(chǎn)物（DCF）相對提高；故，利用偵測 DCF 螢光強度即可得知細胞內(nèi)

活性氧物質(zhì)產(chǎn)生之多寡

并以相對螢光單位（relative fluorescent unit, rfu）為計量單位，表示細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的相對含量

二、螢光染劑：2,7-dichloridihydrofluorescein（H2DCF-DA）: Sigma/molecular probe

三、實驗步驟

1. 移除 24 孔盤中的培養(yǎng)液，再加入 500μl 新的培養(yǎng)液。

2. 每孔加入濃度為 20 mM 的 H2DCF-DA，隨即將 24 孔盤置于細胞螢光測

定儀上（cytofluormetry）；設(shè)定激發(fā)（excitation）波長為 485 nm，發(fā)散

（emission）波長為 530；每三分鐘測讀一次，共計三十分鐘

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